Les Défis du CEA n°161 juin 2011
Les Défis du CEA n°161 juin 2011
  • Prix facial : gratuit

  • Parution : n°161 de juin 2011

  • Périodicité : mensuel

  • Editeur : CEA

  • Format : (200 x 297) mm

  • Nombre de pages : 20

  • Taille du fichier PDF : 3,0 Mo

  • Dans ce numéro : génotoxicologie... ADN/UV, les lésions dangereuses.

  • Prix de vente (PDF) : gratuit

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8 À la une les défis du cea juin 2011 » > Caractérisation de fragments d’ADN par spectrométrie de masse. certaines de ces mutations peuvent provoquer des cancers. « Au début des années 2000, nous avions une très bonne idée des effets des UVB sur l’ADN de la peau, y compris avec les nouvelles méthodes d’analyse que nous avions rassemblées. Or, quelques études sur des bactéries et des cellules de rongeurs suggéraient que, contrairement au « dogme » en vigueur, les rayons ultraviolets A (UVA) pouvaient aussi être mutagènes. Nous avons décidé d’aller voir de plus près », se souvient le chercheur. Les UVA, beaucoup plus abondants que les UVB dans le spectre solaire, mais d’énergie inférieure, sont en effet classiquement considérés comme responsables de la production de radicaux libres, impliqués dans le vieillissement de la peau et pouvant oxyder indirectement l’ADN. D’ailleurs, les études mentionnées par Thierry Douki n’ont pas été prises au sérieux au moment de leur publication : on pensait que les lampes à UVA utilisées produisaient aussi quelques UVB, responsables des effets constatés. Tester désormais sur l’humain L’équipe grenobloise commence alors à travailler sur des cellules d’ovaire de hamster chinois, un modèle cellulaire classique, en collaboration avec Évelyne Sage, du Laboratoire de biologie des radiations de l’Institut Curie. Résultat, les UVA – les chercheurs ont pris la précaution d’utiliser des lampes UVA « pures » qu’ils ont de plus filtrées pour éviter tout UVB parasite – provoquent bel et bien des altérations de l’ADN, les mêmes que les UVB : des dimères pyrimidiques (essentiellement entre deux thymines adjacentes) apparaissent. Bref, comme l’explique aujourd’hui Thierry Douki, « le sujet était relancé, mais sur des lignées de cellules de rongeurs. Il fallait désormais essayer sur l’humain ». Un partenaire industriel, les laboratoires Pierre-Fabre Dermo-cosmétique, qui souhaitent mieux comprendre le mode de fonctionnement de leurs crèmes écrans solaires, s’associent à cette deuxième étape. Des cultures primaires de cellules de peau humaine (kératinocytes, fibroblastes et mélanocytes) sont soumises à des UVA, avec le même résultat : des dimères pyrimidiques se forment. Le laboratoire s’adresse ensuite à l’hôpital de Grenoble, qui lui « fournit » des explants de peau humaine provenant de chirurgies du sein, avec le consentement des donneuses. La dermatologue Marie- Thérèse Lecciade, de l’équipe du professeur Béani, Cultures primaires//Cellules prélevées dans l’organisme et cultivées telles quelles, identiques à celles de leur tissu d’origine. P.Avavian/CEA
numéro 161 les d éfis du cea assiste les chercheurs pour l’irradiation de ces échantillons. Là encore, les UVA provoquent des dimères. Ils font même plus de dégâts de ce type qu’ils ne provoquent le vieillissement de la peau, lié au stress oxydant qu’ils peuvent causer ! « De plus, nous constatons que la couche cornée de l’épiderme, si elle diminue l’endommagement de l’ADN par les UVB, n’empêche pas les UVA de faire des dégâts », ajoute Thierry Douki. Les faits sont désormais bien établis. Reste à comprendre le mécanisme de formation de ces dimères, ainsi que les paramètres biologiques modulant l’effet des UVA. Ce sera l’objet du projet Dimuva, accepté en 2007 par l’Agence nationale de la recherche dans le cadre de son appel « Physique et chimie du vivant ». Pour l’occasion, quatre équipes forment un consortium. Outre le laboratoire de Grenoble, l’équipe de Dimitra Markovitsi, du CEA-Iramis à Saclay, se charge des mécanismes moléculaires de la réaction : que se passe-t-il lorsqu’une base reçoit un photon ? Quels atomes sont excités, comment réagissent-ils ? L’étude des états moléculaires excités, d’une durée de vie infinitésimale, demande en effet des savoir-faire et un appareillage uniques. Comme précédemment, l’Institut Curie étudie les mutations induites par l’apparition des dimères. Enfin, le service de dermatologie du CHU de Grenoble assume la partie clinique auprès de volontaires, en particulier la détermination de l’influence du phototype de la peau sur les dégâts dus aux UVA. Phototype//Type de peau humaine en fonction de sa réaction au soleil, classé de 1 (peau très blanche, tâches de rousseur, ne bronze pas, coups de soleil systématiques) à 6 (peau noire, jamais de coups de soleil). INSTRUMENTATION UNE GAMME COMPLÈTE D’OUTILS En une décennie de recherche, le CEA-Inac a mis au point une panoplie complète d’instruments et de méthodes pour identifier et quantifier les dégâts sur l’ADN, ainsi que pour en vérifier les conséquences biologiques (mutations et taux de réparation). Pour la détection des dommages, deux méthodes se complètent. Celle dite des « comètes », très sensible mais peu spécifique, consiste à visualiser, par électrophorèse puis marquage, la présence d’éventuelles cassures dans l’ADN, sans s’occuper de leur nature. L’autre méthode, utilisée en complément depuis une dizaine d’années, est moins sensible mais très spécifique. Il s’agit de séparer tous les fragments élémentaires de l’ADN par chromatographie en phase liquide (HPLC), puis de rechercher ceux qui sont altérés, par spectrométrie de masse. Si ces méthodes sont devenues courantes dans les laboratoires de biochimie, elles requièrent des appareils coûteux. Pour voir si un défaut, par exemple un dimère, peut induire une mutation, les chercheurs l’incluent dans un court brin d’ADN de séquence connue, puis font « lire » cette dernière par des polymérases, enzymes chargées de « La couche cornée de l’épiderme, si elle diminue l’endommagement de l’ADN par les UVB, n’empêche pas les UVA de faire des dégâts. » Thierry Douki, du Laboratoire des lésions des acides nucléiques, CEA-Inac Des résultats confirmés En ce qui concerne les mécanismes, l’équipe de Saclay doit trancher entre deux hypothèses : soit l’ADN absorbe directement les UVA, comme les UVB, soit les dimères proviennent d’une réaction indirecte : l’énergie des photons UVA est piégée par des molécules dans la cellule, puis transférée dans l’ADN où elle provoque la formation de dimères. « Les chercheurs ont caractérisé les états transitoires de la molécule d’ADN, réalisé des mesures au milliardième de seconde, voire moins, et montré que les UVA agissent directement sur l’ADN », souligne Thierry Douki. Fait surprenant, les UVA n’ont pas d’effet sur les bases pyrimidiques isolées : celles-ci doivent être incluses dans un brin d’ADN pour devenir sensibles aux rayons. L’équipe de Grenoble confirme ensuite le résultat, et mesure le même taux de formation de dimères dans l’ADN pur extrait des noyaux que dans les cellules entières. Cela exclut l’intervention de composés cellulaires comme intermédiaires. En utilisant des filtres, l’équipe de Thierry Douki constate également que, quelle que soit leur longueur d’onde, les UVA sont grosso modo aussi efficaces les uns que les autres pour provoquer l’apparition de dimères. Dans le même ordre copier l’ADN lors de la division des cellules. Si elles se « trompent », c’est donc que le défaut induit une mutation. Enfin, les capacités des cellules à réparer tel ou tel défaut sont testées in vitro avec des enzymes naturellement chargées de la réparation de l’ADN dans les cellules. Pour cela, la collaboration de biologistes a été nécessaire. Quantification des dommages de l’ADN par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. P.Avavian/CEA 9 » >



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