Clefs n°60 été 2011
Clefs n°60 été 2011
  • Prix facial : gratuit

  • Parution : n°60 de été 2011

  • Périodicité : annuel

  • Editeur : CEA

  • Format : (215 x 307) mm

  • Nombre de pages : 104

  • Taille du fichier PDF : 4,5 Mo

  • Dans ce numéro : incontournable chimie.

  • Prix de vente (PDF) : gratuit

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54 Chimie pour la santé et l’environnement CLEFS CEA - N°60 - ÉTÉ 2011 1. oligonucléotides pro-fluorescents contenant une lésion spécifique fluorescence quenchée 1. oligonucléotides fluorescents contenant une lésion spécifique immobilisation sur support 2. incubation avec un lysat cellulaire Figure 4. Représentation schématique du test de détection d’activité de réparation de l’ADN par excision par les enzymes de la REB à l’aide de sondes oligonucléotidiques pro-fluorescentes en solution (en haut) ou fluorescentes sur support (en bas). La figure du haut montre un oligonucléotide auto-complémentaire, contenant une lésion d’intérêt, qui s’organise en duplex dit en « épingle à cheveu » dans laquelle les deux molécules chromophores, situées respectivement à chaque extrémité de la structure, sont très proches. Lors de l’excitation du fluorochrome donneur, à une longueur d’onde spécifique, l’énergie émise par ce dernier est absorbée par le chromophore « quencheur ». La fluorescence est alors éteinte et aucun signal n’est mesuré (1). Lors de l’incubation en solution avec une enzyme de réparation reconnaissant la lésion, ou un extrait contenant des activités spécifiques de réparation, la lésion est coupée et le fluorochrome donneur est libéré simultanément en solution (2). Son excitation à la longueur d’onde spécifique conduit dans ces conditions à une émission de fluorescence qui est quantifiée et augmente avec le temps de digestion (3). On peut ainsi suivre, en temps réel, des cinétiques de coupure enzymatique (4) ; courbes rouge et jaune : quantification simultanée de deux activités de réparation caractéristiques d’un échantillon donné. La figure du bas montre des oligonucléotides contenant des lésions de bases ou de sucre de l’ADN, marqués par un fluorochrome, qui sont immobilisés par hybridation sur une lame de verre préalablement fonctionnalisée, ce qui génère des spots fluorescents (diamètre 250 μm). La fixation simultanée de lésions distinctes, à des positions prédéterminées du support, permet le multiplexage du test et donc la quantification simultanée de plusieurs activités de réparation spécifiques de chaque lésion (1). La biopuce ainsi préparée est incubée en présence d’un extrait cellulaire ou d’enzymes de réparation à caractériser (2). La réparation des lésions fixées sur le support par les enzymes contenues dans le milieu biologique est associée à la coupure des oligonucléotides reconnus et à l’élimination de la fluorescence du support. Par quantification de la fluorescence résiduelle à l’aide d’un scanner, on détermine l’efficacité de coupure des différentes lésions par les enzymes contenues dans le milieu (3) ; les spots rouges de la biopuce avant la réaction deviennent verts après coupure. On établit ainsi des cinétiques de coupure des lésions par les enzymes du milieu et on détermine un phénotype de réparation, caractéristique des capacités de réparation de l’échantillon biologique initial (pourcentage de coupure de chaque lésion). Chaque lame (75x25 mm) comporte 24 biopuces correspondant à 24 réactions menées en parallèle. 1. ADN plasmidique contenant des lésions spécifiques immobilisation sur support excision restauration de fluorescence 2. incubation avec un lysat cellulaire excision élimination de fluorescence 2. incubation avec un lysat cellulaire excision/resynthèse incorporation d’un marqueur fluorescent Figure 5. Représentation schématique du test de détection d’une activité de réparation de l’ADN par excision/resynthèse par les complexes protéiques de la REB ou de la REN à l’aide de sondes plasmidiques immobilisées sur support. Des plasmides contenant des lésions spécifiques en différentes quantités créées par des agents physiques ou chimiques (irradiation ultraviolette, oxydation, photosensibilisation, traitement acide...) sont immobilisés à des positions prédéterminées sur un microsupport recouvert d’un hydrogel (1). Ce dernier permet la préservation, à long terme, de l’ADN. La biopuce ainsi préparée est incubée en présence d’un extrait cellulaire à caractériser (2). La réaction d’excision des lésions et de resynthèse d’ADN intègre par les enzymes contenues dans l’extrait biologique conduit à l’incorporation de fluorescence (étoiles rouges), qui est ensuite mesurée à l’aide d’un scanner (3 : image de la biopuce en fausses couleurs). L’intensité de fluorescence mesurée est proportionnelle à la quantité de lésions présentes sur les plasmides (3 ratios lésion/ADN) et à l’efficacité des enzymes de réparation présentes dans le milieu biologique, et spécifiques de chaque type de lésion. L’histogramme en (4) montre le phénotype de réparation d’un échantillon avec la mesure de 6 activités de réparation différentes (une par couleur). simples à mettre en œuvre et induisant des effets psychologiques et un impact médiatique fort. Comme l’a montré l’attaque au sarin dans le métro de Tokyo, en 1995, l’utilisation d’armes chimiques par des terroristes peut toucher en nombre les populations civiles. La réponse rapide à des attaques de gaz de combat nécessite la mise en place de capteurs permettant une fonction d’alerte extrêmement rapide et spécifique au type de gaz utilisé afin de procéder immédiatement aux procédures de protection, d’intervention et de prise en charge d’éventuels blessés. 3. quantification de la fluorescence 4. détermination du phénotype de réparation 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 temps (min) 3. quantification de la fluorescence 4. détermination du phénotype de réparation 120 100 80 60 40 20 0 0 3. quantification de la fluorescence 4. détermination du phénotype de réparation fluorescence témoin CPD-64 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ThymG Aujourd’hui, il existe divers dispositifs sensibles aux gaz toxiques parfois insuffisants dans certains types de surveillance ou d’intervention. Dans l’avenir, l’essor des nanotechnologies, notamment le couplage de la fonctionnalisation chimique et des nanomatériaux, devrait ouvrir de nouvelles perspectives pour la réalisation de capteurs miniatures, très sensibles et sélectifs pour la détection de composés toxiques. C’est ainsi que des études récentes, menées sur l’utilisation de nanofils de silicium fonctionnalisés par des récepteurs chimiques 8oxo AlkB CisP AbaS CEA CEA
moléculaires, ont permis de mettre en évidence une excellente capacité à détecter immédiatement, et de façon très sélective, des composés toxiques organophosphorés (OP) – famille de molécules neurotoxiques à laquelle appartient le sarin. Le principe de ces nouveaux capteurs repose sur des molécules réceptrices spécifiques à ce type de composés toxiques, préparées en plusieurs étapes de synthèse organique, puis greffées à de très petits fils de silicium d’environ 100 nm de diamètre. En présence du toxique ciblé, les molécules greffées réagissent avec le gaz et créent des charges électriques. Situées à proximité immédiate du nanofil de silicium, celles-ci modifient sensiblement le passage du courant électrique dans le silicium. Par une simple mesure d’intensité électrique du dispositif, au cours du temps, il est alors possible de savoir si les molécules ont réagi, et donc, si la présence de gaz toxique a été détectée (figure 6). Chimie flexible et polyvalente pour les biopuces Aujourd’hui, grâce à des systèmes miniaturisés comme les biopuces, les chercheurs peuvent détecter des molécules-cibles présentes dans un échantillon biologique (marqueurs biologiques). Dans ce cas, les moléculessondes reconnaissant les cibles présentes en solution doivent être fixées sur la surface de la biopuce. Dans les années 2000, l’ADN restait la cible de prédilection et les chercheurs optimisaient leur chimie de manière à pouvoir fixer ce type de molécules. Depuis, le spectre d’utilisation de ces objets a connu une large ouverture allant bien au-delà de l’interaction ADN/ADN. Ainsi peut-on désormais détecter des assemblages moléculaires anticorps/ligands (toxines, allergènes...), voire plus complexes comme des anticorps avec des cellules ou des bactéries. La chimie utilisée pour la fixation de ces différentes classes de molécules doit donc répondre à une série de critères : être polyvalente ; s’adapter au mode de détection de l’interaction utilisé : • fluorescence, résonance plasmonique, mécano-capteur... s’adapter aux procédés de micro, voire de nanostructu-• ration, nécessaires à la construction de la biopuce. Ainsi, le groupe Chimie pour la reconnaissance et l’étude d’assemblages biologiques (Creab) (3) a décidé de travailler sur la fonctionnalisation de couches fines d’or (quelques dizaines de nm) en raison de leurs propriétés optiques particulières, notamment mises en jeu lors de mesures plasmoniques, mais aussi de la facilité de mise en œuvre dans les procédés de microélectronique. Le groupe a donc développé des procédés de dépôts électrochimiques permettant d’immobiliser des molécules sur un grand nombre de supports conducteurs dont l’or. Le principe consiste à fonctionnaliser les molécules-sondes en utilisant un pyrrole puis à les copolymériser avec du pyrrole libre sur une surface conductrice. Cette réaction se déroulant en milieu aqueux salin et à pH neutre, c’està-dire en condition physiologique, celle-ci reste compatible avec de nombreuses molécules d’intérêt biologique, et les interactions mesurées aujourd’hui peuvent s’avérer très diverses. Cela ouvre donc des domaines d’application très peu explorés actuellement. De plus, les procédés de dépôts développés permettent de fonctionnaliser des surfaces, non seulement par des spots de polymère (3) Il s’agit d’un groupe appartenant au Service structure et propriétés d’architectures moléculaires (SPrAM/UMR 5819) fonctionnant au sein de l’Institut nanosciences et cryogénie (Inac). molécules réceptrices élément semi-conducteur conductance temps molécules gaz OP création de charges détection électrique Figure 6. Représentation schématique du système de détection à base de nanofils de silicium comportant des molécules sensibles greffées en surface. La mesure du courant est stable avant la présence de composés toxiques et une augmentation de la conductance électrique s’observe après la réaction des molécules gazeuses sur le nanofil de silicium fonctionnalisé. Sur les écrans est affichée l’évolution, au cours du temps, de la conductance du nanofil fonctionnalisé. À droite, représentation de la molécule de sarin. fonctionnalisé de quelques nanomètres d’épaisseur dont le diamètre peut être ajusté sur une gamme couvrant la centaine de nanomètres jusqu’au millimètre, mais également des surfaces de pores micro ou nanométriques. Cette grande flexibilité d’utilisation permet de s’adapter facilement à des besoins biologiques aussi variés que la détection de toxines rares dans un échantillon d’eau, l’analyse de cellules sanguines, voire au nanopositionnement d’objets... Cette grande souplesse d’utilisation présente un double avantage : celui de s’adapter à un nombre important de procédés de détection d’interactions, optiques ou électrochimiques, avec ou sans traceurs, et celui de couvrir une large gamme d’applications biologiques. Par exemple, en matière de protection de l’environnement, les chercheurs peuvent désormais détecter de façon très sensible des toxines d’agents biologiques ; dans le domaine de la recherche médicale, ces procédés s’utilisent également pour l’évaluation de la réponse immunologique de patients infectés par le virus de l’hépatiteC, la recherche d’oligosaccharides actifs biologiquement, l’organisation et la caractérisation de cellules humaines sur des surfaces microstructurées, etc. Il reste donc primordial que la chimie soit développée en étroite collaboration avec les physiciens impliqués dans les procédés de détection, avec les biologistes responsables des applications, mais également, le cas échéant, avec les industriels concernés par la valorisation des résultats. > Thu-Hoa Tran-Thi Institut rayonnement matière de Saclay (Iramis) Direction des sciences de la matière CEA Centre de Saclay > Sylvie Sauvaigo, Didier Gasparutto, Thierry Livache et André Roget Institut nanosciences et cryogénie (Inac) Direction des sciences de la matière CEA Centre de Grenoble > Jean-Pierre Simonato Institut Liten (Laboratoire d’innovation pour les technologies des énergies nouvelles et les nanomatériaux) Direction de la recherche technologique CEA Centre de Grenoble OP conductance temps Matrice au pas de 20 μm de micro-dépôts d’anticorps (haut) spécifique de certaines cellules sanguines (lymphocytes T). Étant donné la taille des spots (5 μm) et la taille des cellules (10 μm), seule une cellule peut s’installer sur le spot. La matrice d’anticorps est incubée avec l’échantillon biologique et les cellules reconnues s’auto-organisent donc suivant le motif dessiné. Les cellules sont ainsi plus facilement étudiables et des études sur les sécrétions de molécules médiant l’activité immunitaire peuvent être réalisées (bas/Roupioz et coll.). CLEFS CEA - N°60 - ÉTÉ 2011 CEA CEA 55



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